Mikroskopie bei Hepatitisviren
Am Standort Heidelberg wurde eine Mikroskopie-Einheit etabliert, die den Arbeitsgruppen aus dem Forschungsbereich Hepatitis sowie anderen Forschungsbereichen, insbesondere dem Bereich „Neu auftretende Infektionskrankheiten“, „Malaria und vernachlässigte Tropenkrankheiten“ und „HIV“ für deren Analysen zur Verfügung steht. Damit können auch lebende Zellen und Gewebe, die mit Hepatitis- oder anderen Pathogenen infiziert sind, in den für diese Arbeiten notwendigen Laboren der Sicherheitsstufe 2 und 3 untersucht werden. Für verschiedene antivirale Substanzen konnte mit diesen bildgebenden Verfahren bereits der Wirkmechanismus entschlüsselt und die Wechselwirkung zwischen Virus und Wirtszelle charakterisiert werden. Darüber hinaus wurden Verfahren der Elektronen- und korrelativen Mikroskopie etabliert, die auch im Rahmen von Gemeinschaftsprojekten zur Verfügung gestellt werden. Diese Angebote werden durch Fortbildungsmöglichkeiten im Bereich der Licht- und Elektronenmikroskopie ergänzt.
Humanpathogene Hepatitisviren wie etwa das Hepatitis-B-Virus (HBV) oder das Hepatitis-C-Virus (HCV) können nur in Laboren der Sicherheitsstufe 3 untersucht werden. Auf Grund der hohen technischen Anforderungen sind solche Labore nur begrenzt verfügbar und aufwändige Mikroskopietechniken können aus Kostengründen nur selten darin vorgehalten werden. Das ist jedoch ein großes Hindernis, weil sich Viren und viele andere Pathogene nur in lebenden Zellen studieren lassen.
Hepatitis C Lebenszyklus im Film
Aus diesem Grund wurde in der Abteilung von Prof. Bartenschlager eine Einrichtung etabliert, die es erlaubt, Zellen, die mit Hepatitis- oder anderen Pathogenen infiziert sind, auch unter hohen Sicherheitsbedingungen zu untersuchen. Diese Einrichtung umfasst die Mikroskopie von lebenden Zellen, beispielsweise um die Dynamik des Infektionsereignisses oder die Wirksamkeit antiviraler Medikamente zu studieren. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dass Daclatasvir und andere NS5A-Inhibitoren die Vermehrung des Hepatitis-C-Virus u. a. dadurch blockieren, dass das Virus keine Replikationsfabriken mehr ausbilden kann. Die Arbeitsgruppe Mikroskopie bei Hepatitisviren spielte auch eine entscheidende Rolle bei der Beschreibung eines neuen Ausbreitungswegs von HCV innerhalb eines Zellverbandes durch extrazelluläre Vesikel. Diese Vesikel verwenden das zelleigene Lipoprotein-System und entkommen den antiviralen Antikörpern des Immunsystems.
Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) von Leberzellen, die mit genetisch veränderten Hepatitis-C-Viren (HCV) infiziert und mit dem Medikament Daclatasvir behandelt wurden. Oben links: Fluoreszenzmikroskopie der lebenden Zellen. Die mit dem weiß gepunkteten Rechteck markierte Zelle ist im mittleren Bild vergrößert dargestellt. Oben rechts: Überlagerung von elektronenmikroskopischem Bild (EM) und dem Fluoreszenzbild derselben Zelle. Von den gelb markierten Bereichen wurden EM-Aufnahmen gemacht, die in der mittleren Reihe zu sehen sind. Die mittlere Reihe zeigt EM-Bilder von Zellen, die mit einem Daclatasvir-resistenten HCV infiziert wurden. Die Behandlung hat keinen Effekt auf die Ausbildung der Replikationsfabriken (blaue Pfeile). Die untere Reihe zeigt EM-Bilder von Zellen, die mit einem Daclatasvir sensitiven HCV infiziert wurden. Man beachte, dass die Daclatasvir-Behandlung die Bildung der Replikationsfabriken vollständig inhibiert (erkennbar durch die Abwesenheit von Vesikeln mit einer Doppelmembran). Die Vesikel sind stets in unmittelbarer Nähe zu Lipidtröpfchen („lipid droplets“, LD) zu finden.
Darüber hinaus erlaubt die Mikroskopie-Einheit im Rahmen von Kooperationsprojekten die Analyse von Zellen oder Geweben, die auch mit anderen Viren infiziert sind. So wurde in enger Zusammenarbeit mit dem Forschungsbereich „Neu auftretende Infektionskrankheiten“ mit diesen Verfahren die Struktur der Replikationsfabriken des Zikavirus entschlüsselt und es konnte gezeigt werden, dass Inhibitoren des Zytoskeletts die Vermehrung dieses Virus in menschlichen neuronalen Zellen hemmen. In zahlreichen Kooperationsprojekten konnte die Arbeitsgruppe Mikroskopie bei Hepatitisviren außerdem den Wirkmechanismus eines neuen Inhibitors gegen das Dengue Virus entschlüsseln sowie ein Angriffsziel gegen das humane Norovirus identifizieren. Diese Ergebnisse wurden insbesondere mit Hilfe der korrelativen Mikroskopie erzielt, einer Kombination aus Licht- und Elektronenmikroskopie. Während der SARS-CoV-2-Pandemie identifizierte die Arbeitsgruppe Mikroskopie bei Hepatitisviren die viralen und zellulären Komponenten, die für die Bildung der Replikationsfabriken von SARS-CoV-2 benötigt werden. Sowohl die SARS-CoV-2 Proteine als auch die benötigten zellulären Komponenten können als Angriffspunkte zur gezielten Therapie einer SARS-CoV-2 Infektion dienen. Sie war auch entscheidend bei der Entwicklung von bildbasierten Analyseverfahren zur Charakterisierung von SARS-CoV-2 Virionen beteiligt.
Elektronentomographie von Zikavirus (ZIKV)-induzierten Replikationsfabriken in humanen Neuronen-Vorläuferzellen. Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Infektion fixiert, in Epoxidharz eingebettet und mittels Elektronentomographie analysiert. Links: Einzelbilder eines Tomogramms, die ZIKV-induzierte Vesikel (Ve) innerhalb des rauen Endoplasmatischen Retikulums (ER) sowie Virionen (Vi) zeigen. Maßstab: 100 nm. Rechts: 3D-Oberflächenmodell des gelb markierten Bereiches. ER-Membranen sind hellblau, Virus-induzierte Vesikel dunkelblau, Virionen goldfarben und Intermediärfilamente rot dargestellt. Die Größenskala entspricht einer Länge von 200 nm.
Ein wichtiges Element dieser Mikroskopie-Einheit ist das Fortbildungsangebot im Bereich der Licht- und Elektronenmikroskopie. Dieses Angebot, das in enger Zusammenarbeit mit der Mikroskopie-Einheit HIV gemacht wird, umfasst die Anwendung etablierter und neuer Mikroskopiemethoden, aber auch Vorgehensweisen zur Analyse der lichtmikroskopischen Bilder und deren Quantifizierung.
